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类器官（或细胞）的冻存和复苏

需选用生长状态良好的类器官（或细胞）进行冻存实验。

类器官（或细胞）的冻存

1. 向离心后的类器官（或细胞）中加入预冷的（2-8℃）Organoid Cryopreservation Medium（类器官冻存液），吹打混匀后迅速转移至细胞冻存管中（冻存管内细胞悬液体积应大于 0.5mL）。

注意1：每 1mL 冻存液推荐冻存 1x103-1x107 个细胞或对应细胞量的类器官。

注意2：冻存体积过大的/多层上皮的/鳞状细胞组成的类器官时，由于这类结构紧密，可使用类器官消化液适当消化3-15分钟再使用基础培养基清洗2次后进行冻存。

2. 将冻存管放入细胞冻存程序降温盒内（降温盒须提前平衡至室温或 4℃），随后立即将降温盒放入-80 ℃超低温冰箱中；也可将冻存管进行人工梯度降温处理，如 4℃ 静置 10 分钟，-20℃保存 1 小时，-80℃保存过夜。

3. 次日或 12 小时后将冻存管于低温条件下（不高于-70℃，推荐使用干冰或原降温盒）转移至液氮中长期保存。

类器官（或细胞）的复苏

1. 提前在 37℃条件下预热类器官（或细胞）所需的基础培养基。

2. 在 37℃的水浴中快速解冻细胞冻存管，当冻存管内冻存物仅剩些许冰渣残留时立即停止水浴并及时转移至洁净操作台。

3. 将冻存悬液转移至离心管中，缓缓加入 5-10 倍体积的预热的基础培养基，轻轻混匀。

4. 将上步骤所获类器官（或细胞）悬液进行离心（水平离心转子，150-300g，3 分钟），弃上清，再次加入基础培养基重悬类器官（或细胞）沉淀。

5. 将上步骤所获类器官（或细胞）悬液进行离心（水平离心转子，150-300g，3 分钟），弃上清后所获类器官（或细胞）可用于后续类器官（或细胞）的培养。