类器官的出现带人们突破了二维培养物的限制，从而能够更加全面地，从更高层次探索生物体中未被挖掘的机制以及形态发生的奥妙。然而，目前的类器官培养技术仍存在很大的限制，所培养出的类器官大多为表皮干细胞培养出的单胚层类器官，这极大限制了类器官对人体的模拟程度。

最近，美国辛辛那提儿童医院医学中心的James M. Wells团队于2021年12月在Cell Stem Cell杂志上发表了一篇题为“Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells”的文章，向人们展示了他们构建的新型三胚层类器官，并将以此为基础进一步探索不同组织结构在胃的发育中起到的作用。

胃肠（gastrointestinal）所有器官均由胚胎发育过程中源自三胚层的细胞组装而成，胃肠的正常发育以及其众多复杂功能的执行离不开三胚层及其所发育成的器官之间的相互作用。胃壁自内向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层，涵盖了内胚层发育而来的上皮和腺体、中胚层发育而来的平滑肌、以及外胚层发育而来的壁内神经丛，任一器官的损伤都会导致各种复杂的先天性或获得性疾病。然而，目前所能构建的胃类器官仅限于包含上皮组织的单胚层类器官，复杂的人体结构模拟效果不佳，迫切需要多胚层类器官的构建。

首先，作者将中胚层来源的间充质与上皮类器官组合。通过抑制TGF-β和WNT同时激活BMP促进体外壁细胞的形成，干细胞被诱导分化为侧板中胚层，同时获得形成心脏间充质和内脏间充质的潜力。随后，添加维甲酸诱导侧板中胚层向内脏间充质分化。（图1）

图1. 双胚层胃类器官构建方法

随后，作者将间充质与上皮类器官进行了整合。通过对胃窦类器官进行测试发现，当间充质以5万个细胞/孔并且与上皮细胞比例为2:1的方式整合到人胃窦类器官时，可以在上皮周围形成一层稳固的间质层。（图2）

图2. 双胚层类器官免疫荧光染色

然而，与完整的人体结构相比，尽管将间充质与上皮类器官进行了结合，仍无法模拟具有单层柱状上皮的腺体结构。因此，作者在双胚层类器官的基础上加入外胚层衍生结构。首先作者制备了外胚层衍生的肠道神经嵴细胞，接着，将神经嵴细胞与间充质及胃窦类器官进行组装，在体外培养4周后移植到小鼠体内继续生长10 - 12周。（图3）

图3. 三胚层类器官构建方法

最后，为了确定构建的多胚层类器官能否生长并形成与人胃更相似的组织结构，作者将类器官移植到小鼠的肾包膜中并生长10 - 12周，将所得组织与38周胎儿和成人胃的切片进行比较。结果显示，间充质的存在促进了类器官在体内的存活，并生长成平滑肌层；与双胚层类器官相比，增添了神经嵴细胞的三胚层类器官能够形成与人体胃组织相类似的腺体状结构，平滑肌层有序排列，神经元嵌入其中形成了一种丛状结构的神经网络，与38周的胎儿胃结构一致，并显示出了多种胃窦细胞的类型。（图4）

图4. 多胚层类器官的体内构建及与人胃结构对比

染色的对比证明了类器官结构上与人胃的高度相似，随后，作者针对类器官中平滑肌的收缩情况探究该具备神经肌肉单位的类器官是否与胃具有功能上的相似性。作者从类器官中分离出组织条，并将其置于器官水浴系统（organ bath chamber system）中检测其收缩性。无论是两双胚层还是三胚层类器官都能自发发生收缩震荡，表明这两种类器官中都出现了能够介导自主神经系统和平滑肌之间通的信cajal间质细胞（ICC）。不过，双胚层类器官中的收缩活动是不规则的，而具有神经嵴细胞的三胚层类器官则是高度规则的。

最后，作者又通过添加甲酰甲胆碱、东莨菪碱等激动剂或拮抗剂进一步验证了构建的多胚层类器官功能结构上的完善性。（图5）

图5. 多胚层类器官平滑肌收缩测试

这项研究开发了由源自人类多能干细胞的三胚层细胞组装而成的包含功能性肠道神经系统、平滑肌层和分化腺体的人胃类器官，证明了多胚层类器官构建的可能性，并为其他类器官的开发提供了强大的范例。目前实验室所构建的类器官包含了多种不同类型的细胞，并将它们组合成不同的3D结构，然而，这些类器官还局限于单胚层结构，且缺少神经、血管、腺体或免疫细胞等完整器官所需的各种因子，极大局限了类器官在研究中对人体的模拟程度。这项研究所构建的多胚层类器官将间充质，神经嵴细胞与上皮类器官进行了整合，构建出了具有腺体，平滑肌与神经的类器官，虽然未能完全模拟人体器官，但也展示了类器官技术的进步与非凡潜力。未能达到的完美也意味着发展与机遇。在这项研究中构建的类器官虽然包含了三胚层结构，但不同胚层的生长进程却存在差异，导致三个胚层之间的联系与互作受到了很大的影响。此外，无法进行体外培养亦是一个需要攻克的难关。

因此，实现体外构建三胚层同步发育的类器官，解析人体发育中各组织器官间的互作，并在类器官中实现再造，推动类器官技术不断发展，是伯桢生物作为拥有国际领先类器官技术的公司的使命。

这项研究开发了由源自人类多能干细胞的三胚层细胞组装而成的包含功能性肠道神经系统、平滑肌层和分化腺体的人胃类器官，证明了多胚层类器官构建的可能性，并为其他类器官的开发提供了强大的范例。目前实验室所构建的类器官包含了多种不同类型的细胞，并将它们组合成不同的3D结构，然而，这些类器官还局限于单胚层结构，且缺少神经、血管、腺体或免疫细胞等完整器官所需的各种因子，极大局限了类器官在研究中对人体的模拟程度。这项研究所构建的多胚层类器官将间充质，神经嵴细胞与上皮类器官进行了整合，构建出了具有腺体，平滑肌与神经的类器官，虽然未能完全模拟人体器官，但也展示了类器官技术的进步与非凡潜力。